A traditional medicine, respiratory detox shot (RDS), inhibits the infection of SARS-CoV, SARS-CoV-2, and the influenza A virus in vitro
Brian Hetrick1, Dongyang Yu2, Adeyemi A. Olanrewaju1, Linda D. Chilin1, Sijia He1, Deemah Dabbagh1,Ghaliah Alluhaibi1, Yuan - Chun Ma3, Lewis A. Hofmann4, Ramin M. Hakami1 and Yuntao Wu1*
▋摘要
背景：目前为止正为患世界的新型冠状感染疾 (SARS-CoV-2) 已在 220 多个国家所和内陆地区大流行，截至 2021 年 4 年底已所致有约 1.28 亿人染疾，有约 280 都来丧命。举例来说，已为可必要降低 COVID-19 误杀率的化疗工具。我们学术研究了一种宗教性的里药口服制剂——厌肺毒口服液 (RDS) 的潜在抑制冠状感染活性，该口服液主要糖类为--------医学宗教性里用做化疗消化道疾疾的里草药。
结果：RDS 抑制作用 SARS-CoV 太快感染、SARS-CoV-2 太快感染、混合禽流感疾毒感染-SARS-CoV-2(Ha-CoV-2) 假型感染以及传染性 SARS-CoV-2 和派生的 Ha-CoV-2 变种感染 (B.1.1.7、B.1.351、P.1、B.1.429、B.1.2、B.1.494、B.1.1.207、B.1.258 和 B.1.1.298) 对外源质的染疾。我们有利于不可否认 RDS 可以反之亦然灭活 SARS-CoV-2 感染薄上皮细胞的传染性。此外，我们推断造出 RDS 还可切断禽流感疾毒菌株对外源质的染疾。
结论：RDS 可国际上抑制作用消化道感染染疾。标签：SARS-CoV-2，COVID-19，冠状感染，抑制感染化疗，厌肺毒口服液，宗教性里药，SARS-CoV，禽流感疾毒禽流感，Ha-CoV-2，SARS-CoV-2 假型感染
▋背景
目前为止正为患世界的新型冠状感染疾 (SARS-CoV-2) 已在 220 多个国家所和内陆地区大流行，截至 2021 年 4 年底已所致有约 1.28 亿人染疾，有约 280 都来丧命。举例来说，已为可必要降低 COVID-19 误杀率的化疗工具。新造出现的 COVID-19 感染疾原体为冠状感染 SARS-CoV-2[1]，是 SARS-CoV 在比较严重急性呼出气综合征相关冠状感染一般来说里的姊妹感染[2,3]。SARS-CoV 和 SARS-CoV-2 在此之后都是在里国推断造出的；SARS-CoV 感染于 2002 年 11 年底在广东省首次被推断造出[4-6]，SARS-CoV-2 则于 2019 年 12 年底在长沙首次被推断造出[1,7,8]。在里国，这两次由冠状感染引来的疫情里，里药之外被国际上常用，用以先行应对冠状感染引来的疾疾。对于举例来说的 COVID-19 大流行，里国有有约 85% 的 SARS-CoV-2 染疾患者遵从了宗教性里医药药物（9，10）。许多常用的里药究竟带有必要的抑制冠状感染特性并在药理学上究竟必要，这个重要问题仍未获得合理答复。
里药作为化疗冠状感染所引发疾疾的必要药物，但由于欠缺体内或粘液的系统学术研究，其发展与合理常用之外受到了阻碍。为了未确定里药的潜在抑制 SARS-CoV-2 活性，我们从常用里药里筛选了多种草药甜菜，并从里药口服液 RDS(宾夕法尼亚州一种商业化性饮品摄入) 里推断造出了抑制 SARS-CoV 和抑制 SARS-CoV-2 感染的活性，一种在宾夕法尼亚州的商业化饮品摄入。RDS 用做减太快人体肺的相比之下身体健康，其相关联多种草药糖类，如籽和蒲公英，它们是宗教性上用做控制呼出气道和消化道疾疾的里草药 (11-13)。在此，我们华盛顿邮报 RDS 对 SARS-CoV、SARS-CoV-2 假感染以及带有染疾性的野生型 SARS-CoV-2 感染对外源质的染疾带有糖皮质激素。我们有利于证明了 RDS 可通过反之亦然灭活感染薄上皮细胞或解救感染赶造出而抑制作用感染的一时期染疾延迟。此外，我们推断造出 RDS 还可以解救乙禽流感染对外源质的染疾。这些表明，RDS 对消化道感染的染疾有可能带有国际上的糖皮质激素。
▋结果
为了从宗教性里草药里找造出潜在的抑制 SARS-CoV-2 活性，我们从约四十种宗教性草药里筛选合成造出 SARS-CoV-2S 细胞假型太快感染[14,15] 和人体消化道 A549(ACE2) 外源质，此有机体 ACE2 基因会通过太快感染转导作为多种形式依赖性，从而稳定转导来实现微表达造出来。太快假型感染常用蓝色荧光细胞 (GFP) 或荧光抑制真菌作用酶 (Luc) 作为华盛顿邮报基因，并通过了带有广谱抑制感染转至抑制作用剂，以及萨拉巴格 (Arbidol)[16]，和有机体抑制毒血清对抑制 SARS-CoV-2(由此可知 1a、C) 的正确性。我们尽有可能取得成功验证到萨拉巴格 (Arbidol) 和抑制毒血清对于 SARS-CoV-2 假型感染的糖皮质激素，这是我们在其他四十余种宗教性草药甜菜测试里不能推断造出的，以外其里一些实际上较差口服的草药 (由此可知 1a-C)。然而，鉴于太快性假型感染至少能验证 SARS-CoV-2 感染的赶造出蓄意，我们必须回避这些草药甜菜有可能有在转至后下一阶段尽有可能抑制作用 SARS-CoV-2 的有有可能。我们有利于从宗教性抗生素厌肺毒口服液 (RDS) 里筛选造出了有可能的抑制 SARS-CoV-2 活性，该产品含都可草药糖类——、茴香、籽、蒲公英、紫菀、苦杏仁、蜂房、皂角、绿叶，在里国宗教性上用做化疗消化道疾疾 (11-13)。
含羧酸冰淇淋酸、3，4-二邻冰淇淋酰基苯乙酸酸、羧酸 3，4-二邻冰淇淋酰基苯乙酸酸、原儿茶酸、羧酸绿原酸和瑞香草抑制真菌作用；花蕾里还含氨酸 A、B 和 10 种已知环酚醚CHO氨酸[17]；该木本植物还含皂甙甙 A 和 B，以及抑制呼出气道作用的氨酸 C[18,19]。茴香衍有机体氨酸里含木脂抑制真菌作用、松脂醇和茴香氨酸[20]。籽里含被称为籽皂氨酸的甾体皂氨酸，是籽种属木本植物近似于的木本植物化学物质[21,22]。细叶蒲公英里主要活性糖类为四种单CHO，(−)-香草酮、(+)-博巴德酮、(−)-柠檬酚和 (+)-香草呋喃；这种木本植物还含其他锂，如 1-辛酚-3-醇、3-辛酮、β-金盘酚和β-漆树酚[23]。紫菀含有约 162 种锂，以外环酚醚CHO和环酚醚CHO氨酸、苯丙氨酸、纤维素、醇类、甘油、黄酮类、和皂氨酸[24]。苦杏仁里含酚类、重氮锂和果胶多糖[25]。皂角刺里含皂氨酸和羽扇豆酸[26,27]，而绿叶里含主要活性糖类绿叶酸[28]。为了有利于测试 RDS 的抑制 SARS-CoV-2 活性，用相异混和溶解度的 RDS 程序中 A549(ACE2) 细胞质，然后让这些细胞质在实际上 RDS 的前提遵从 4-6 全程的染疾。染疾后，在不实际上 RDS 的前提培训细胞质，然后在 48 和 72 全程的时候，通过流德式细胞质拳法对感染染疾的糖皮质激素同步进行举例来说。为了控制细胞质口服，常用乙酸丙啶 (PI) 对即将丧命和已丧命的细胞质同步进行染色剂，至少在活细胞质群里分析方法 GFP+细胞质。如由此可知 2 右图，我们掩蔽到 RDS 对 SARS-CoV-2(GFP) 假感染带有副作用持续性糖皮质激素。为了得出结论这些结果，我们常用可抑制表达造出来 ACE2 的 VeroE6 细胞质移位了该染疾测试。
(不知下页由此可知)
ACE2 之下表达造出来，而今 SARS-CoV 和 SARS-CoV-2 感染可对其同步进行染疾，ACE2 一般来说用做冠状感染的学术研究 (7)。难以实现在欠缺 ACE2 微表达造出来 [15，29，30] 的前提，假型感染对 VeroE6 的染疾性较高，我们还常用了荧光抑制真菌作用酶华盛顿邮报基因假型感染，该感染的华盛顿邮报表型造出来由 HIV-1LTR 和 Tat 涡轮机，带有更高的华盛顿邮报基因敏感性和准确性。
由此可知 2：RDS 抑制作用 SARS-CoV-2(GFP) 假型感染染疾 A549(ACE2) 细胞质。
A.A549(ACE2) 细胞质用 RDS 周内混和 30 分钟后，用 SARS-CoV-2(GFP) 假型感染染疾。将细胞质扫去感染和 RDS，并在不实际上 RDS 的前提同步进行培训。流德式细胞质明为验证感染染疾抑制作用情况。未染疾的细胞质和染疾 SARS-CoV-2(GFP) 但不经 RDS 化疗的细胞质作为依此。GFP+细胞质多于已看出。(PI) 乙酸丙啶。
B.RDS 的细胞质口服系统性。A549(ACE2) 细胞质用 RDS 周内混和 4 全程，扫去 RDS，无 RDS 培训 48 全程。乙酸丙啶染色剂认定正要丧命细胞质和已丧命细胞质，流德式细胞质拳法分析方法。描画副作用-反应会细胞质口服弧线，RDS 的半误杀溶解度 (LC50) 分之一为 1:11.9。
如由此可知 3A 右图，我们常用 Luc 统计数据基因假感染和 VeroE6 细胞质同步进行染疾测试，掩蔽到 RDS 对该感染染疾带有副作用持续性糖皮质激素，并且半数抑制作用溶解度未确定为 1:230RDS 混和度 (由此可知 3B)。我们还举例来说了 RDS 对 VeroE6 细胞质活力的不良影响，未确定了 50% 细胞质丧命副作用为 1:11.8RDS 混和度。
由此可知 3：RDS 对 SARS-CoV-2(Luc) 假感染和野生型 SARS-CoV-2 感染的副作用持续性抑制作用糖皮质激素。用 RDS 周内混和程序中 A、BVeroE6 细胞质，并用 SARS-CoV-2(Luc) 假型感染染疾。将细胞质扫去感染和 RDS，并在不实际上 RDS 的前提同步进行培训。在染疾后 72 全程用荧光抑制真菌作用酶验证感染染疾的糖皮质激素。未染疾细胞质和 SARS-CoV-2-luc 染疾但不经过 RDS 化疗的细胞质作为依此。测试移位三次。描画副作用反应会弧线和 RDS 的 I-C50 混和分之一为 1:230。CRDS 对 VeroE6 细胞质的细胞质口服也通过乙酸丙啶染色剂和流德式细胞质拳法系统性。用 RDS 周内混和 4 全程，扫去 RDS，在不含 RDS 的前提培训 72 全程。描画细胞质口服副作用-反应会弧线，RDS 的半误杀溶解度 (LC50) 分之一为 1:13.8 混和。DRDS 抑制作用传染性 SARS-CoV-2 染疾。用周内混和的 RDS 程序中 VeroE6 细胞质，并在 RDS 实际上的前提染疾 SARS-CoV-2。染疾 48 全程后，通过僵菌斑分析方法感染释放后的感染镜像抑制作用情况。抑制作用试验一德式共五同步进行，并在 Prism7(Graph Pad) 里常用单向方差 (One-Way ANOVA) 分析方法及 Dunnett 后检查 (Dunnett's Post Test)，借以未确定统计显着性。不确定性值用上标声称如下：*p
为了有利于正确性常用假感染拿到的结果，我们测试了 RDS 对于 SARS-CoV-2 染疾的切断传染性控制能力。如由此可知 3D 右图，RDS 同时也切断了 SARS-CoV-2 对 VeroE6 细胞质的染疾。RDS 在混和 1:40 以上时可相当大减少感染斑点的构成。
综上，通过 SARS-CoV-2 假感染与传染性感染的表明，RDS 含抑制作用 SARS-CoV-2 染疾的活性糖类，有可能是通过反之亦然灭活感染或切断感染的一时期染疾延迟。
为有利于学术研究有可能的机制，我们将传染性 SARS-CoV-2 感染薄上皮细胞与周内混和的 RDS 在 37°C 下预培训 1 全程。随后，将组分有利于依次混和-(10–1 至 10–4)，并延入 Vero 细胞质同步进行僵菌斑分析方法以未确定感染染疾性的降低。如由此可知 4A 右图，我们掩蔽到在 RDS 里年中沾染一全程后的感染薄上皮细胞，其 SARS-CoV-2 的染疾效价也红褐色副作用持续性上升。该结果得出结论了 RDS 可必要反之亦然灭活 SARS-CoV-2 感染薄上皮细胞的传染性。
我们有利于测试了 RDS 究竟也能抑制作用 SARS-CoV-2 感染变种的染疾。为此，我们利用最近开发的混合乙感染-SARS-CoV-2 假型感染 (Ha-CoV-2)[31] 来分离出一前传 S 细胞类似于，以外英国类似于 (B.1.1.7)，南非类似于 (B.1.351)，巴西类似于 (P.1)，延州类似于 (B.1.429)，和其他几个新兴类似于 (B.1.2，B.1.494，B.1.1.207B.1.258，B.1.1.298)。Ha-CoV-2(Luc) 和相关 S 细胞相异体在 37°C 周内混和 RDS 培训 1 全程。随后，用该组分染疾 HEK293T(ACE2/TMPRESS2) 外源质。染疾后 12 全程，荧光抑制真菌作用酶推算造出感染染疾的糖皮质激素。如由此可知 4B 右图，我们还掩蔽到了 RDS 对 Ha-CoV-2(Luc) 和所有 S 细胞类似于的副作用持续性抑制作用。
我们还测试了 RDS 切断 SARS-CoV 染疾的控制能力，常用带有 SARS-CoV 突刺细胞的 GFP 华盛顿邮报基因太快感染和[15] 伪副作用。我们将人 A549(ACE2) 细胞质用作外源质，将其用前传混和的 RDS 程序中，然后用 SARS-CoV(GFP) 统计数据基因假感染染疾 4-6 全程。染疾后在不含 RDS 的前提培训细胞质，流德式细胞质拳法举例来说验证其对感染染疾的糖皮质激素。值得注意，常用乙酸丙啶回避正要丧命与已丧命的细胞质，至少在活细胞质群里分析方法 GFP+细胞质。如由此可知 5A 右图，我们掩蔽到 RDS 对 SARS-CoV(GFP) 假型感染的糖皮质激素红褐色副作用持续性。我们有利于得出结论了这些结果，并举例来说了 RDS 依赖性的抑制作用与 Luc 华盛顿邮报基因 SARS-CoV 假型感染，SARSCoV(Luc)。我们掩蔽到 RDS 对 SARS-CoV(Luc) 和的糖皮质激素红褐色副作用性依赖，其半抑制作用溶解度 (IC50) 为 1:70.88 混和度 (由此可知 5B，C)。难以实现 SARS-CoV 和 SARS-CoV-2 都常用 ACE2 染疾外源质，我们还测试了 RDS 的抑制感染活性究竟至少针对与 ACE2 有相互作用的冠状感染。为此，我们验证了一种不相关的负链 RNA 感染----禽流感疾毒菌株。它通过感染血凝抑制真菌作用 (HA) 和细胞质α-唾液酸来染疾外源质。为了分离出禽流感疾毒菌株，将表达造出来禽流感疾毒禽流感 A/WSN/33(H1N1) 基因组每个非常简单版的 8 个多种形式和一个 GFP-华盛顿邮报基因共转染到 HEK293T 细胞质里。在 RDS 实际上的前提，搜集感染薄上皮细胞并用做染疾前提 MDCK 细胞质。如由此可知 6A 右图，我们掩蔽到 RDS 对禽流感疾毒菌株的糖皮质激素红褐色副作用持续性。RDS 在 1:40 和 1:80 混和时可只不过切断感染染疾，在 1:160 混和时则可部分抑制作用禽流感疾毒禽流感。RDS 对 MDCK 细胞质的半误杀溶解度 (LC50) 经推算造出为 1:18.5(由此可知 6B)。这些表明，RDS 的抑制感染活性并非针对特定感染，而有可能尽有可能国际上抑制作用多种消化道感染，如冠状感染和禽流感疾毒菌株。
▋提问
在本统计数据里，我们不可否认宗教性抗生素厌肺毒口服液 (RDS) 含广谱抑制感染活性，可切断 SARS-CoV、SARSCoV-2 和禽流感疾毒菌株的染疾。虽然 RDS 尽有可能抑制作用多种感染，但其抑制感染活性因感染类型和毒株而异。例如，对 SARS-CoV 太快假感染的 I-C50 溶解度为 1:7.9 混和度，对 SARS-CoV-2 太快假感染的 I-C50 溶解度为 1:230 混和度。对于传染性野生型 SARS-CoV-2 感染，I-C50 为 1:40 混和度，对禽流感疾毒禽流感，其 I-C50 为 1:250。RDS 对 Ha-CoV-2 及其变种有相异的糖皮质激素，IC50 倍数从 1:70 到 1:2601 混和度不等 (由此可知 4B)。
(不知下一页由此可知)
由此可知 4 RDS 对 SARS-CoV-2 和派生的 Ha-CoV-2 变种带有副作用持续性灭活作用。ASARS-CoV-2 薄上皮细胞延周内混和的 RDS 在 37°C 下培训 1 全程。随后，将组分有利于周内混和，并延入 Vero 细胞质里同步进行僵菌斑分析方法，以未确定感染染疾性降低。抑制作用试验一德式共五同步进行，并在 Prism7(GraphPad) 里常用单向方差 (One-WayANOVA) 分析方法和 Dunnett 后检查 (Dunnett'sPostTest) 借以未确定统计显着性。不确定性值用上标声称如下：*p
BHa-CoV-2(Luc) 和相关 S 细胞类似于与周内混和的 RDS 在 37°C 培训 1 全程后，用组分染疾 HEK293T(ACE2/TMPRESS2) 外源质。染疾后 12 全程，荧光抑制真菌作用酶推算造出感染染疾的糖皮质激素。RDS 的 IC50 值的混和度为 1:177(wt)，1:828(B.1.1.7)，1:124(B.1.351)，1:88(P.1)，1:134(B.1.1.207)，1:2601(B.1.1.298)，1:70(B.1.258)，1:362(B.1.429)，1:163(B.1.494)，1:137(B.1.2)。
我们有利于不可否认 RDS 可以抑制作用冠状感染的一时期染疾延迟。虽然只不过一致的抑制感染机制仍未清楚，但 RDS 可以通过反之亦然灭活感染薄上皮细胞或通过解救感染赶造出或切断感染赶造出后的一时期延迟来解救感染染疾。在其他几种宗教性里药里也推断造出了抑制 SARS-CoV 和 SARS-CoV-2 的活性。例如，一种常不知的宗教性里药——绿叶。
绿叶根里已证明了含绿叶酸抑制真菌作用，抑制真菌作用 SARS 感染[32] 药理学裂解株的镜像。此外，另一种可用做化疗消化道疾疾的里药——双黄连制剂，已看出造出在粘液以副作用持续性方德式抑制作用 SARS-CoV-23CL 甘油 (3CLpro) 活性。冬青氨酸和冬青抑制真菌作用拟作为双黄连切断 3CLpro[33] 的必要糖类。
由此可知 5 RDS 抑制作用 SARS-CoV 假型感染对 A549(ACE2) 细胞质的染疾。用周内混和的 RDS 程序中 A、B 细胞质，用 SARS-CoV(GFP)(A) 或 SARSCoV(Luc)B 假型感染染疾。将细胞质清扫，填入感染和 RDS，在不实际上 RDS 的前提同步进行培训。在染疾后 48 全程和 72 全程，通过流德式细胞质拳法或荧光抑制真菌作用酶验证来系统性感染染疾的糖皮质激素。测试移位三次。描画副作用响应弧线，并描画 RDS 的 IC50 值为 1:70.9 混和度 (C)
由此可知 6 RDS 抑制作用乙禽流感染对 MDCK 细胞质的染疾。(A) 用周内混和的 RDS 程序中 MDCK 细胞质 30 分钟，然后用乙禽流感染 (GFP) 对其同步进行染疾。染疾后，在 RDS 实际上下培训细胞质。36 全程后用流德式细胞质明为对感染染疾的糖皮质激素同步进行系统性。把未染疾的细胞质与被乙禽流感染 (GFP) 染疾但不经 RDS 执行的细胞质同步进行对比。由此可知里看出了 GFP+细胞质的多于。PI 声称乙酸丙啶 PI。
(B) 另外还常用了 MTT 推算造出法系统性了 RDS 对 MDCK 细胞质的口服，描画了细胞质口服的副作用-反应会弧线，经数值，RDS 的半数误杀溶解度为 1:18.5 混和度 RDS 的必要抑制感染糖类仍未未确定。然而，RDS 相异于冬青氨酸和冬青抑制真菌作用，RDS 可以通过反之亦然灭活感染相对论性来切断感染染疾 (由此可知 4)，而冬青氨酸和冬青抑制真菌作用则在感染生命周期的初通过切断感染甘油的活性来缺少。然而，RDS 的粘液抑制 SARS-CoV-2 活性仍才可在短期内的爬虫类学术研究和有机体药理学试验里获得得出结论。目前为止，我们正要同步进行小型爬虫类测试，以未确定 RDS 在体内切断 SARS-CoV-2 感染染疾的潜能。
▋结论
我们的学术研究表明，RDS 可国际上抑制作用消化道感染的染疾，如 SARS-CoV、SARS-CoV-2 和禽流感疾毒禽流感。
▋工具
细胞质和细胞质培训
HEK293T (ATCC 佩拉奇克，新泽西州) MDCK (ATCC 佩拉奇克，新泽西州)，VeroE6 (ATCC 佩拉奇克，新泽西州) 和 A549 (ACE2) (来自 Virongy LLC 赐与，佩拉奇克，新泽西州)，和 HEK293T (ACE2/TMPRESS2) (来自 Virongy LLC 赐与，佩拉奇克，新泽西州) 目前为止留存于 Dulbecco's modifiedEagle's medium (DMEM) (赛默飞世尔新技术 Thermo Fisher Scientific) 含 10% 微灭活 FBS 和 1×青霉抑制真菌作用-链霉抑制真菌作用 (赛默飞世尔新技术 Thermo Fisher Scientific)。在 HEK293T (ACE2/TMPRESS2) 细胞质培训基里分别以 1μg/ml 和 200μg/ml 的溶解度延入嘌呤霉抑制真菌作用和潮霉抑制真菌作用 B。
线粒体转染和感染分离出
含 SARS-CoVS 细胞或 SARS-CoV-2S 细胞的太快性假型感染薄上皮细胞由 Virongy LLC (Manassas，VA) 包括，或按照下面揭示的工具[15] 分离出。简言之，为了分离出 GFP 华盛顿邮报基因太快性假感染，HEK293T 细胞质与表达造出来 SARS-CoVS 细胞或 SARS-CoV-2S 细胞的多种形式、pCMVΔR8.2 和 pLKO.1-puro-TurboGFP 共转染。为了产造出荧光抑制真菌作用酶华盛顿邮报基因太快性假型感染，将 HEK293T 细胞质与表达造出来 SARSCoVS 细胞或 SARS-CoV-2S 细胞的多种形式、pCMVΔR8.2 和 pLTR-Tat-IRES-Luc 同步进行共转染。转染后 48 全程搜集感染上清液，离心成品，−80℃ 留存。野生型 SARS-CoV-2 感染 (Isolate USA-WA1/2020) 由 BEI Bioresources (Manassas，VA) 包括。pHW-NAGFP (ΔAT6) 统计数据基因线粒体和 A/WSN/1933 H1N1 派生线粒体 pHW2000-PB2、pHW2000-PB1、pHW2000-PA、pHW2000-HA、pHW2000-NP、pHW2000-NA、pHW20000M 由 FengLi 指导教授友好包括。在菌株 A-GFP 华盛顿邮报基因相对论性分离出里，将 pHW2000-pb2、pHW2000-pb1、pHW2000-PA、pHW2000-ha、pHW2000-np、pHW2000-na、pHW2000-m、pHW2000-ns 和 pHW-NA-GFP 共转染 HEK293T 细胞质 (ΔAT6)。48 全程后搜集感染上清液。SARS-CoV-2S、M、E、N 表达造出来多种形式购自 Sinobiological。利用 Twist Bioscience 合成了 Ha-CoV-2(Luc) 多种形式和 S 细胞相异多种形式。Ha-CoV-2(Luc) 和 S 细胞相异相对论性按照下面揭示工具[31] 同步进行分离出。
感染染疾和抗生素抑制作用试验
RDS(厌肺毒口服液)(来自 Dejia Harmony 赐与，利斯堡，新泽西州) 是由两匹指导教授测试室 (Burnaby，BC，Canada) 生产的一种商业化产品。RDS 里所有里草药糖类之外具备《里国药典 2015 年版》「饮片」准则，以外必要糖类含量及重金种属、无毒限量验证。RDS 是一种里药的共煎剂，终于产物在高热条件下蒸发。SARS-CoV-2 抑制血清由 LanceA. Liotta 医生包括。将萨拉朵尔盐酸盐 (Sigma) 原先水或在二羧酸亚砜 (Sigma) 里。对于假型感染染疾，12 孔板里的 A549(ACE2) 细胞质 (来自 Virongy LLC 赐与，佩拉奇克，新泽西州) 或 VeroE6 细胞质用 RDS 程序中 30 分钟，在 37℃ 下染疾 4-6 全程，然后在新鲜培训基里温水培训 48-72 全程。对于 VeroE6 细胞质的染疾，细胞质也被 CoV-2 假型感染染疾减太快剂 (CoV-2PIE) (来自 Virongy LLC 赐与，佩拉奇克，新泽西州) 程序中后，在 37°C 下再执行 30 分钟。常用 GloMaxDiscover 酶标明为 (Promega) 分析方法细胞质裂解物的荧光抑制真菌作用酶活性。对于野生型 SARS-CoV-2 染疾，VeroE6 细胞质在 37°C 下用 RDS 程序中 30 分钟，然后用 MOI 为 0.05 染疾 SARS-CoV-2 (Isolate USA-WA1/2020；BEI Bioresources) 在乔治奥利弗医学院的 BSL-3 眷属基础设施内停留 1 全程。细胞质用 PBS 温水 2 次，用含 RDS 的培训基培训 48 全程。从上清里合成感染，用 12 孔板培训的 Vero 细胞质单层里的僵菌斑试验推算造出小瓶滴度。简言之，每个试样在非常简单的 Dul-becco's ModifiedEagle 培训基 (VWR) 里分离出，相关联 1X 青霉抑制真菌作用-链霉抑制真菌作用 (VWR)，并添延 10% 的 FBS(赛默飞世尔新技术 Thermo Fisher Scientific)。然后将 200 微升的每种混和液悬浮到 VeroE6 细胞质单层的三个垂直孔上 1 全程。然后用 1～2 ml0.6% 琼脂糖 (Invitrogen) 和一部分非常简单的 Eagle Minimal Essential 培训基 (VWR) 的组分遮盖单层，含 1X 青霉抑制真菌作用-链霉抑制真菌作用，并添延 10%FBS。48 全程后，将单层上皮细胞固定在 10% 乙醛溶液里 1 全程，并移除遮盖的琼脂拉。为了染色剂斑点，延入含 20% 盐酸的 1% 结晶三叶原料溶液 5 分钟，然后用去离子水温水。对于禽流感疾毒菌株染疾 MDCK 细胞质，在 37°C 下用 RDS 程序中 30 分钟，然后用 A-GFP 华盛顿邮报基因感染染疾 6 全程。用含 RDS 的培训基温水细胞质，培训 36 全程。GFP 表达造出来通过流德式细胞质明为系统性。(FACSCalibur，BD Biosciences).
对于 SARS-CoV-2 感染薄上皮细胞的 RDS 灭活试验，将 100μl 周内混和的 RDS 添延到 1 mlSARS-CoV-2 感染原液 (3.65×105PFU/ml) 里，终于 RDS 混和为 1:20，1:40 或 1:80。也以外依此条件 (1 ml 感染+100μl 培训基)。组分在 37°C 下培训 1 全程。随后，对组分同步进行前传混和以转化成额外的 1:10、1:100、1:1,000 和 1:10,000 混和度，并将周内混和的试样延入 12 孔板里的 Vero 细胞质里，用做同步进行僵菌斑推算造出分析方法。斑点推算造出里终于的 RDS 混和度为 1:200 至 1:200,000；1:400 到 1:400,000；和 1:800 到 1:800,000 的 RDS 混和液。
Ha-CoV-2(Luc) 和 S 细胞相异相对论性按照下面揭示的工具[31] 分离出。对于 Ha-CoV-2(Luc) 的 RDS 灭活，将 5μl 周内混和的 RDS 添延到 45μlHa-CoV-2(Luc) 或类似于里，终于 RDS 混和度为 1:20、1:40、1:80、1:160 或 1:320。将组分在 37°C 下培训 1 全程，然后在 RDS 实际上下染疾 HEK293T (ACE2/TMPRESS2) 细胞质 12 全程。常用 GloMax Discover 酶标明为 (Promega) 分析方法细胞质裂解物的荧光抑制真菌作用酶活性。
细胞质口服分析方法验证
用乙酸丙啶染色剂和流德式细胞质拳法举例来说对 A549 (ACE2) 细胞质和 VeroE6 细胞质的抗生素细胞质口服同步进行验证，如举出 (34)。常用细胞质增殖试剂盒 I(MTT) (Sigma) 和制造商建议的建议对 MDCK 细胞质的抗生素口服同步进行举例来说。简言之，将 MDCK 细胞质 (ATCC) 以每孔 1×-105 个细胞质的速度快接种到 12 孔板里。细胞质培训隔夜后，通过 RDS 执行 1 天，然后在 MTT 标明试剂 (Sigma) 的培训基里培训。将细胞质与标明试剂主导培训 4 全程，再后续延入 MTT 增溶液。培训皿孵蛋过夜，用 GloMax Discover 酶标明为 (Promega) 推算造出出气光度。
略称
SARS-CoV：比较严重急性肺症候群相关冠状感染；SARSCoV-2：Severe 比较严重急性肺症候群相关冠状感染-2；TCM：宗教性里药；RDS：消化道摄入口服液；Ha-CoV-2：混合禽流感疾毒新冠感染假感染。
致谢
非常感谢 FengLi 包括菌株表达造出来多种形式，非常感谢 LanceLiotta 包括抑制毒血清；非常感谢 TedCi，HeSun，ZhigangGao，WanyingWu 的提问与建议；非常感谢 KevinCarter、MarkMamdar、RichKeurajian、KarenFreidouni 包括 RDS 和草药甜菜。
所写成就
此次测试由 Y.W.，R.H. 和 L.A.H. 设计，由 Y.W. 撰稿，由 L.A.H. 编辑。B.H.，D.Y.，A.A.O.，L.D.C.，S.H.，D.D、GA 及 YM 执行了该测试。所有所写已写出并同意终于稿子。
资金
本学术研究的经费来自于乔治奥利弗医学院之下拨款 223741(DeJiaHarmony/Anti-SARS-CoV-2)，该款项由德佳和畅 (DeJiaHarmony) 包括。
资料和材料的可用性
本学术研究里转化成或分析方法的所有资料之外相关联在本文里。试剂可从 Y.W 处获取。
单方面
同意及参予同意
不限于
同意造出版
不限于
竞争利益
乔治奥利弗医学院国家所有机体布署和传染疾里心的 RMH 和 YW 已拿到了德佳和畅 (DejiaHarmony) 的学术研究资助，LAH 为德佳和畅担任顾问并拿到了酬金。不能其他关系或文艺活动就会不良影响到提交的工作。
所写详细信息
1宾夕法尼亚州新泽西州乔治奥利弗医学院认知科学学院国家所有机体布署和传染疾里心，佩拉奇克 20110。
2VirongyLLC，新泽西州佩拉奇克。3延拿大福纳比，BCV5J0E5 两匹指导教授测试室 (Dr.Ma's LaboratoriesInc.)。4 宾夕法尼亚州新泽西州利斯堡世界卫生科学组织，20176。
收稿日前：2021 年 4 年底 7 日
遵从日前：2021 年 5 年底 10 日
线上造出版时间：2021 年 5 年底 29 日
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编辑： 翟微男相关新闻
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